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Nature Medicine：人类LRRK2功能丧失变异的影响

发布时间：2020-10-22 19:00:00来源：

近日，顶尖学术期刊Nature以封面文章形式发表了gnomAD的系列研究成果，其中Nicola Whiffin等人在Nature Medicine上也发表题为“The effect of LRRK2 loss-of-function variants in humans”的研究论文，该研究系统地分析了来自基因组数据库gnomAD中测序的141,456名个体、英国生物样本库（UK Biobank）中全外测序的49,960名个体、及23andMe公司基因型数据库中400多万名个体的LRRK2蛋白编码基因的功能丧失性（pLoF）变异。经过严格的解读后，鉴定出1,455名携带高度可信的LRRK2pLoF变异的个体。结合此前的研究及三种变异的实验验证结果，证实了该队列中82.5％的个体的蛋白水平降低。该研究显示LRRK2中的杂合pLoF变异降低了LRRK2蛋白水平，但这与任何特定的表型或疾病状态均未密切相关。该研究结果证明了大规模基因组数据库和人类功能丧失性携带者表型分析对于药物发现中靶标验证的价值。

背景介绍

帕金森病（PD）是一种最常见的与年龄相关的神经系统疾病，影响了约1%的60岁以上人群，因此迫切需要新的治疗策略。约30%的家族性和3-5%的散发性帕金森病病例与遗传因素相关。目前已知LRRK2是帕金森病的一个主要致病基因，且已知LRRK2中激酶功能获得性变异可显著增加帕金森病的患病风险，这表明抑制LRRK2激酶活性有望成为帕金森病的潜在治疗策略。

大规模的人类遗传学研究是发现和验证人类治疗靶点的越来越强大的数据来源。pLoF变异是一类信息量特别丰富的遗传变异，预测可主要或完全地消除受累等位基因的功能。这种变异是终生抑制靶基因的自然模型，可以提供有关候选靶标的有效性和安全性的信息。在药物靶向评估中利用pLoF变异通常需要收集大量具有遗传特征和表型特征的个体，并对目标基因和候选变异进行深入的研究。

研究人员鉴定出LRRK2 pLoF变异，并评估了三个具有遗传特征的大型个体队列的相关表型改变。首先，在两个大型测序队列中注释出LRRK2 pLoF变异，并发现gnomAD中的633名个体和英国生物样本库中的258名个体共携带150个独特的LRRK2功能丧失（LoF）性候选变异，其总携带频率为0.48%。整理后去除了其中不太可能导致真正LoF的低质量或注释错误的变异（图1a）。最终的数据集包括携带134个高度可信的pLoF变异的255名gnomAD个体和97名英国生物样本库个体（图1a），其携带频率为0.19%。其次，检查了来自23andMe公司400多万名参与者的LRRK2 pLoF变异，并鉴定出8个用功能丧失转录本影响评估器（LOFTEE）推定高可信度的LRRK2pLoF变异。人工处理后，每个变异的所有推定携带者都提交给Sanger测序验证，并且排除了小于5个确定携带者的变异。由此产生的队列包括749个个体，每个经Sanger确定的携带者都携带三种pLoF变异中的一个（图1a）。这三个组合的数据集共提供了1455名携带者个体和134个独特的LRRK2 pLoF变异。这些变异存在于所有主要的大陆种群中（图1b），既未表现出任何沿着LRRK2蛋白长度的明显聚集，也未在任何已知的注释蛋白质结构域中出现特定的富集或匮乏（图1c），与真正的LoF特征一致。

图1. 候选LRRK2 pLoF变异的注释和管理

a. 流程图显示了gnomAD、英国生物样本库（UK Biobank）和23andMe队列中候选LRRK2 LoF变异的筛选和管理。在23andMe队列中鉴定出的1103名携带者中，经Sanger测序验证确定了749名，其余未经检测。

b. gnomAD数据库中LRRK2 pLoF变异携带者的祖先分布。AFR，非洲裔/非裔美国人；AMR，美国/拉丁美洲人；ASJ，阿什肯纳兹犹太人；EAS，东亚；FIN，芬兰人；NFE，非芬兰欧洲人；SAS，南亚。10次以上的pLoF变异以彩色显示，其余变异则以灰色显示。大多数LRRK2 pLoF变异在个体间极为罕见（携带频率低于1/10000），除了两个几乎只存在于混合美国/拉丁美洲人群体的无义变异（Cys1313Ter和Arg1725Ter）和两个主要为非芬兰欧洲人特异性变异（Leu2063Ter和Arg772Ter）。所有变异蛋白的描述均以ENSP0000298910.7为参考。

c. 通过位置标记pLoF变异的LRRK2基因示意图，其标记高度与gnomAD（灰色条）和英国生物样本库（蓝色条）中的等位基因数目相对应。其中51个外显子用不同颜色的矩形表示不同的蛋白质结构域，其余外显子为灰色。23andMe队列中基因分型的三种变异用黑色文本标注其样本数目。

为了证实LRRK2 pLoF变异导致LRRK2蛋白水平降低，研究人员分析了具有三种独特pLoF变异的细胞系的总蛋白裂解物。在所有情况下，与非携带者对照组相比，LRRK2蛋白水平肉眼可见地降低（图2），这与先前的研究一致。总的来说，此项研究中82.5%（1201/1455）的pLoF携带者具有这六个经功能验证的变异。

图2. 与无LoF变异的细胞相比，杂合型LRRK2 pLoF变异使LRRK2蛋白降低

a. 对5例无pLoF变异（LRRK2-WT）和3例杂合型（Het）pLoF变异（Cys1313Ter；12-40699748-T-A；Arg1483Ter；12-40704362-C-T）的淋巴母细胞样细胞系进行LRRK2和上样对照GAPDH的免疫印迹。实验重复了十次，结果相似。

b. 对胚胎干细胞分化的心肌细胞中的3个对照细胞系和1个CRISPR/Cas9编辑的LRRK2杂合细胞系（Arg1693Ter-12-40714897-C-T）进行LRRK2、α-辅肌动蛋白（肌肉特异性）和GAPDH的免疫印迹。所有变异蛋白的描述均以ENSP0000298910.7为参考。实验重复了五次，结果相似。

接下来，研究人员试图确定LoF引起的长期LRRK2蛋白水平降低是否会导致寿命明显缩短。在gnomAD或23andMe数据集中，发现LRRK2 pLoF变异携带者和非携带者的年龄分布无显著差异（图3a），这表明对寿命无显著影响。另外，研究人员进行了一项全表型关联研究，比较LRRK2 pLoF携带者和非携带者的366个健康相关性状，发现任何个体表型与携带者状态之间均无显著关联（图3b）。

图3. LRRK2 pLoF变异与年龄分布或任何不良表型间均无显著相关性

a. 在gnomAD和23andMe数据集中，LRRK2 pLoF携带者与非携带者的年龄分布无显著差异。注意，此分析基于样本采集时的年龄。

b. 23andMe队列中，三种LRRK2 pLoF变异的携带者与非携带者的全表型关联研究结果的曼哈顿图。每个点代表一个不同的表型，并按照相关类别分组（用交替的黑点和灰点表示）。虚线代表366次试验的Bonferroni校正P值。逻辑回归用于二元表型，线性回归用于年龄、性别、基因分型平台和前10个遗传主成分的数量表型控制。

英国生物样本库资源包括30个血清和4个尿液生物标志物的测量结果。研究者发现这些生物标志物在pLoF的携带者和非携带者间无任何差异。特别是，转化为肾功能临床指标的尿液生物标志物（图4a）及通常用于评估肝功能的六种血液生物标志物在携带者和非携带者之间均无差异（图4c）。同时，肺功能的肺活量测定也无差异（图4b）。

图4. LRRK2 pLoF携带者无任何肺、肝或肾功能损伤

对于所有曲线图，每个pLoF携带者用青绿色的点表示，非携带者用灰色的点表示。平均值和1 × s.d.用黑色圆圈和线表示。

a. 将尿生物标志物白蛋白和肌酐转化为肾功能的两个临床标志物。pLoF携带者未出现肾功能严重受损的迹象。ACR，白蛋白与肌酐的比值。

b. 肺功能的年龄、性别和身高校正后的肺活量测定Z评分。FVC，用力肺活量；FEV，1 秒内的用力呼气量。

c. 肝功能的血清生物标志物。碱性磷酸酶、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、胆红素和肌酐曲线被截顶，分别去除47、29、92、8和27名非携带者。在完整的数据集上计算小提琴图和汇总统计数据。所有pLoF携带者均在每个绘图区内。

研究人员承认此项研究存在多种局限性。首先，研究所依赖的异质性表型数据主要来自自我报告的问卷调查。23andMe和gnomAD数据集都只记录了招募时的年龄，这并非一个理想的寿命指标，与帕金森病的典型发病年龄相比，参与者相对年轻。此外，在目前的样本量下，只能检测到对寿命的强影响。由于是有针对性的基因分型而非测序数据，因此对23andMe队列中LRRK2 pLoF变异的调查必然不完全。另外，也未直接评估LRRK2 pLoF变异是否会降低激酶活性，而是将蛋白水平的降低作为一个指标。若发生生物代偿，LRRK2的终生LoF可能不等同于治疗性失活。最后，LRRK2 pLoF变异自然发生的低频率导致可用于评估每种生物标记物和表型的携带者相对较少，这意味着无法很好地检测由LRRK2单倍剂量不足而引起的微小或罕见的临床表型。然而，此项研究表明，任何与LRRK2部分降低相关的临床表型都可能比早发性帕金森病更为良性。

总结

该项研究为伴有全面变异解读、具有遗传特征和表型特征的特大型队列，在探索候选药物靶点的安全性时提供了一个重要的原则性证据。在未来的几年里，能得到数十万深入分型个体和/或用于基于基因型研究的再联系个体的完整外显子组或基因组序列数据，再结合对候选pLoF变异的深入解读和实验验证，将为治疗靶点验证以及更广泛的人类基因生物学研究提供强有力的资源。