在《Base editing correction of hypertrophic cardiomyopathy in human cardiomyocytes and humanized mice》文章中，确定了一个腺嘌呤碱基编辑器（ABEs）和单链向导RNA（sgRNA）系统，在选定的位点以最小限度的旁观者编辑（bystander editing）和脱靶编辑可以有效地纠正MYH7基因上的p.R403Q致病变异（PV）。结果表明，在源自肥厚型心肌病（HCM）患者的诱导性多能干细胞（iPSc）心肌细胞和HCM人源化小鼠模型中，碱基编辑成分的传递可挽救HCM的病理表现。该研究证明了碱基编辑在治疗遗传性心脏病方面的潜力，并促进了腺嘌呤碱基编辑器疗法的进一步发展，以纠正导致心脏病的单基因变异。

最常见的遗传性心脏病是肥厚型心肌病（HCM），它是由编码心肌肌小节相关蛋白的基因变异引起，并导致异常的心肌肥厚。HCM的并发症包括心力衰竭、心律失常和心原性猝死。MYH7（编码β-肌球蛋白）的显性负向c.1208G>A（p.R403Q）变异是一种常见且研究充分的PV，可导致心脏收缩力增加和HCM发病。

HCM患者iPSCs的ABE纠正效率

为了将ABEmax-VRQR和h403_sgRNA系统应用于疾病模型，研究人员从2名携带MYH7^403/+ PV（HCM1^403/++和HCM2^403/+）的HCM患者中获得了人类iPSCs。通过ABEmax-VRQR-P2a-EGFP和h403_sgRNA的质粒转染、GFP+细胞荧光激活细胞分选来纠正MYH7^403/+变异（图1a）。通过高通量测序（HTS），尽管有98%-99%的靶点编辑，但在使用生物信息学工具CRISPOR后确定的8个检测候选脱靶基因座的所有58个腺嘌呤碱基上，脱靶DNA编辑极少甚至没有（0.12%或更少）（图1b）。结果表明，具有ABEmax-VRQR的h403_sgRNA可以有效且特异性地纠正目标致病性错义变异，在检测的脱靶位点仅需极少的旁观者编辑和很少或没有DNA编辑。

ABE编辑患者来源iPSC-CMs的功能分析

为了研究基因编辑纠正是否能减少HCM患者的超收缩力的产生，研究人员将iPSC-CMs以单细胞密度放置在柔软的聚二甲基硅氧烷表面上，记录心肌细胞（CMs）收缩的高帧率视频并计算峰值收缩力（图1c）。由于先前的研究表明p.R403Q HCM变异导致ATP消耗增加和细胞代谢改变，接着又通过基因编辑纠正后的代谢通量测定评估细胞能量学的变化（图1d）。结果表明，在人类HCM的CMs中，PV的纠正足以挽救超收缩表型并恢复正常的细胞能量。

图1. 基于碱基编辑纠正的HCM患者iPSC-CM的功能分析

HCM生物学人源化小鼠模型的建立

与人类心脏中主要表达的β-肌球蛋白重链异构体不同，成年小鼠心脏主要表达α-肌球蛋白重链异构体，由MYH6编码。以往的HCM小鼠模型都是用MYH6突变直接替代MYH7突变以解释表达差异，但这二者在蛋白编码区并不是完全相同的，因此用于人类基因组的sgRNA和编辑策略无法直接应用至小鼠模型。为了使用人类序列特异性碱基编辑策略进行临床前研究，研究人员建立了一个人源化小鼠模型，在小鼠MYH6基因中包含MYH7 c.1208G>A（p.R403Q）人类错义变异，该基因也具有PV上游和下游的至少21个核苷酸的人类DNA序列同一性，以便检测人类基因组特异性CRISPR策略。另一个MYH6等位基因包含未修饰的小鼠基因组序列。这种人源化小鼠模型（MYH6^h403/+）反映了先前描述的MYH6 p.R403Q小鼠模型的表型。

人类HCM小鼠模型的体内ABE治疗

研究人员首先试图通过挽救MYH6^h403/h403小鼠来验证双AAV9 ABE系统的效率，这些小鼠在出生后一周内就会死亡。值得注意的是，目前没有报道人类患者具有纯合子基因型。用生理盐水、低剂量（4×1013 vg kg-1）或高剂量（1.5×1014 vg kg-1）的AAV9（低剂量共为8×1013 vg kg-1，高剂量共为3×1014 vg kg-1）向P0（出生后第0天）的MYH6^h403/h403幼崽胸腔内注射，并监测其发育情况。结果MYH6^h403/+和MYH6^WT小鼠在断奶后存活并进入成年。高剂量小鼠心脏的互补DNA（cDNA）的Sanger测序表明，在转录水平上致病性核苷酸纠正了35%，这表明双AAV9 ABE系统能够在心脏中进行基因编辑（图2）。

由于MYH7 p.R403Q变异仅以杂合形式存在于人类患者中，接下来又设置了双AAV9 ABE系统来预防MYH6^h403/+小鼠中HCM疾病的发生。结果发现，与MYH6^WT对照组相比，MYH6^h403/+小鼠的HCM特征增加，包括舒张期左室前壁（LVAW）厚度增加和舒张期左室后壁（LVPW）厚度增加。这些小鼠在舒张期和收缩期的左室内径减小，左室射血分数（EF）和左室缩短分数（FS）增加。MYH6^h403/+小鼠的心室壁厚度增加，心室直径减小以及正常高值FS，这与人类患者的临床进展一致。这些数据表明，双AAV9 ABE系统治疗足以预防HCM介导的心脏病理性重塑的发生（图2）。

图2. 对Myh6h403/+小鼠进行双AAV9 ABE系统编辑预防HCM

而在《Efficient in vivo genome editing prevents hypertrophic cardiomyopathy in mice》文章中，研究人员构建了可模拟人类肌球蛋白R403Q突变的小鼠模型，其病理特征和人类疾病表现类似，包括左心室肥大、心室腔缩小以及心肌纤维化。基于该动物模型，研究人员评估了两种不同的基因疗法——腺嘌呤碱基编辑器（ABE8e）和由AAV9递送的强效Cas9核酸酶，来预防携带杂合HCM致病变异肌球蛋白R403Q的小鼠发生心脏病变。利用单剂量的AAV9双载体，每个载体携带一半的RNA引导的ABE8e，纠正了≥70%的心室心肌细胞的致病变异，并保持了持久且正常的心脏结构和功能。额外的剂量虽然提升了心房处的编辑效率，但也增加了旁观者编辑现象的发生。RNA引导的Cas9核酸酶的AAV9递送有效地灭活了致病等位基因，但由于剂量依赖性的毒性，需要一个狭窄的治疗窗口来维持健康。这些临床前研究表明，单剂量基因疗法在纠正或沉默致病变异、预防HCM发展方面具有相当大的潜力（图3）。

图3. 致病性变异R403Q的AAV9-Cas9沉默和R403Q-129SvEv小鼠的心脏功能

以上两项基于基因编辑的新精准疗法的临床前研究，为HCM模型的成功基因编辑提供了希望，虽然将其转化为人类患者还需面临各种挑战，但单剂量明确的治疗方法不仅适用于HCM，也适用于基因敲除或过度表达策略不适用的众多其他遗传性综合征，因此是一个非常值得追求的目标。在未来，基因编辑应用于临床的精准治疗指日可待！

参考文献

[1] Chai AC, Cui M, Chemello F, et al. Base editing correction of hypertrophic cardiomyopathy in human cardiomyocytes and humanized mice. Nat Med, 2023 Feb; 29(2): 401-411.

[2] Reichart D, Newby GA, Wakimoto H, et al. Efficient in vivo genome editing prevents hypertrophic cardiomyopathy in mice. Nat Med, 2023 Feb; 29(2): 412-421.